組み替えでオン！ Turning on by recombination

Creリコンビナーゼと認識配列であるloxPを組み合わせたシステムは、条件依存的な遺伝子発現のコントロール系として現在の生命科学研究に欠かせないツールとなっています。

Cre-loxP システム解説 (Wikipedia)

認識配列にはバリアントがあって、これをうまく組み合わせると「遺伝子をひっくり返してスイッチオンする」というシステムが作れます（DIO: Double-floxed inverted ORFとか、FLEX: Flip excisionと呼ばれます）。

バリアント1つだと、挟まれている配列は順方向と逆方向を行ったり来たりしますが、

2つ組み合わせると、入れ替わった後に固定されます。

(2021.1.16 lox配列の表記ミスについて指摘がありましたので差し替えました)

これを考えた人は本当に頭がいいと思います。。。

元文献をたどっていくと、[Schnütgen, Nat Biotech 2003] に行き着きました。ここではloxPとlox511が使われています。

しかし、これだけ普及している系の提唱論文なのに、引用は149しかない！(Google scholar調べ)。なんとも過小評価気味な。

どうやら当初はあまり評価されず、あまり長い遺伝子を組み込めないアデノ随伴ウイルス(AAV）システムに実装する際に「再発見」されたという経緯のようです。2007-2008年頃にneuroscienceの大御所の先生方が使われています[Atasoy, J Neurosci 2008; Cardin, Nature 2009]。ここではloxPとlox2722が使用され、並べ方が2通りあるようです（それぞれをDIO/FLEXと呼んでいるようですが、この辺の区別はよくわかりません。。）

シンプルさとエレガントさが同居していて、自分が好きな系の一つです。

Reference :

A directional strategy for monitoring Cre-mediated recombination at the cellular level in the mouse.

Schnütgen et al. Nature Biotechnology 21, 562-565, 2003.

A FLEX Switch Targets Channelrhodopsin-2 to Multiple Cell Types for Imaging and Long-Range Circuit Mapping.

Atasoy et al. The Journal of Neuroscience, 28, 7025–7030, 2008.

Driving fast-spiking cells induces gamma rhythm and controls sensory responses.

Cardin et al. Nature 459, 663–667, 2009.

QPCRのトラブル、夏の幽霊？ A trouble in QPCR by summer ghost?

昨年夏のある日、その前日まで動いていた定量PCR (QPCR) が突然動かなくなりました。定量値がテンプレート量と全く相関せず、melting curveを見るとピークが2本。シグナルが意味するところはつまるところコンタミネーション。

「まあ夏だし、こんなこともあるか」と気軽に考えてトラブルシューティングを始めるも、何をやっても回復せず。

結局夏が終わり、秋になっても回復せず。私の夏はQPCRのトラブルシューティングに消えました orz

最近になって、なぜか回復しています。変更したのはmixtureを準備する場所。部屋を変え、クリーンブースを置きました。複数の人が再現よく動かせているので、回復したものとみなしています。

場所の問題? 

とにかく、元の場所で何かを操作する（たとえば、ウェルプレートを取り出す、プライマーを分注する、試薬を開ける）ということをすると、そのロットはたちまちダメになっていたのです。部屋に大量のコンタミ物質が浮いているかのごとく。「夏の幽霊」の正体は結局わからずじまいです。ビルの空調か、はたまた部屋内でマウスを扱っていた影響か（ずいぶん広い部屋なのですが！）。

QPCRはもう10年以上動かしている系ですが、こんなトラブルは初めてでした。メーカーのサポートの方にもずいぶんお世話になりましたが、その方曰く「建物中の部屋でやってもダメで、外でやったら動いたことがありました。」はあ。

謎のコンタミにお困りの方、ご参考にされてください。

In my long career of QPCR experiments, I experienced the biggest trouble in the last summer. One day, suddenly, signal showed a severe contamination and the condition never recovered after numbers of troubleshooting (e.g., changing all the reagents and lot, washing and replacing micropipetter, etc.) among the summer. 

Recently, this comes to the end, apparently due to the reason that we changed the place for preparing the mixture: we moved the room, and set a clean booth with HEPA filter. 

It’s difficult to believe that this was the only reason, but I can’t help thinking the room air had some problems… maybe of the air flow with contamination throughout the building, or animal handling in the same room. But after all, I cannot find out the ‘summer ghost’ bringing the trouble I spent all the summer for.